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HE染色太简单,细胞学技术

发布时间:2019-08-27 02:32编辑:医学科技浏览(55)

    弹力纤维染色方法的改良探索 发布时间:2018-11-05

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    ALGORITHMS FOR HER2 TESTING


    IHC: 检测蛋白质的过度表达

    ISH: 检测基因扩增状态

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    推荐的HER2评分方法

    注意1 和2 的区别:

    1 :faint/barely perceptible or weak incomplete 薄膜粘连在>10%细胞上

    2 : 弱的/温和的 完全的薄膜粘连在>10%或者强壮的完全的在<10%上的粘连

    3 注意:

    Membrane staining must be intense and uniform and resemble chicken-wire. Ignore incomplete or pale membrane staining in the percentage estimation.


    核心提示:概述及注意事项:细胞学检查包括有细胞的涂片与染色技术,其来源先于组织切片技术,目前是较为常用的病理检查方法之一。它所运

    关键词:特染; 弹力纤维; 优化; 体会;

    HE染色

    乳腺癌HER2检测指南

    概述及注意事项:

    弹力纤维染色技术对于辅助诊断, 特别是对肺癌临床分期具有重要意义, 因此在日常病理诊断中, 弹力纤维染色尤为重要。弹力纤维较坚固, 弹性大, 容易伸展, 在结缔组织中起弹性作用。弹力纤维分布广泛, 特别是皮肤、血管壁、韧带、气管、肺泡等。在常规HE染色中弹力纤维难与其他纤维区别, 只有用特殊染色的方法才能清晰的显示。总结日常工作对弹力纤维染色法进行优化后比较, 做出以下体会。

    HE染色即苏木精-伊红染色法( hematoxylin-eosin staining ),是石蜡切片技术里常用的染色法之一。苏木精染液为碱性,主要使细胞核内的染色质与胞质内的核糖体着紫蓝色;伊红为酸性染料,主要使细胞质和细胞外基质中的成分着红色。

    组织标本的制备

    1.标本类型:(1)手术切除标本;(2)粗针穿刺活检标本;(3)麦默通活检标本。

    2.标本固定:所有乳腺癌标本离体后都应尽快固定(1 h内)。固定时应将标本每隔5~10 mm切开,并可在组织间嵌入纱布或滤纸等物。固定液量与所浸泡组织的比例应足够。固定时间以6—72 h为宜。

    3.固定液类型:4%中性(磷酸缓冲)甲醛固定液。

    4.组织切片:(1)未染色的切片置于室温不宜超过6周,以防抗原丢失。(2)用于IHC染色者切片厚度以3~5μm为宜,ISH法以4—5μm为宜。(3)完成检测的切片,IHC和亮视野ISH可按常规长期保存,FISH结果应立即照相存档并于一20℃保存,建议至少保存3个月备查。(4)各种检测方法均应有HE染色切片作为对照。

    细胞学检查包括有细胞的涂片与染色技术,其来源先于组织切片技术,目前是较为常用的病理检查方法之一。它所运用的范围也很广泛,如女性生殖系统、食管、胃、肺、浆膜腔积液、泌尿管道、鼻咽部等部位的脱落癌细胞,以及胸、腹腔的肿块、淋巴结、乳腺、和其它组织器官的细胞学诊断。

    1 材料与方法

    一张做工精良的HE切片是病理医生得以做出正确诊断的关键。HE染色是目前国内外病理诊断上广泛采用的 常规染色方法。切片质量的好坏,可直接影响疾病诊断的及时与准确性。因此,能制作出一张高质量的HE染色切片,是必须掌握的技术之一。

    IHC

    1.观察程序:应先在低倍镜下观察整张切片,判断染色是否满意及是否存在HER2表达的异质性。正常乳腺上皮不应出现强的细胞膜着色。只评定浸润癌的着色情况,导管原位癌的着色不能作为评定对象。观察细胞膜着色的浸润癌细胞的比例及着色强度,若出现细胞质或细胞核着色提示IHC染色效果不理想或组织处理不佳,建议调整染色条件或更换组织后再行染色。判读时应避开组织边缘及组织处理不佳(如明显挤压)的癌组织。

    2.结果判读及注意事项:结果判读标准(按每张切片计;图1,2):0:无染色或≤10%的浸润癌细胞呈现不完整的、微弱的细胞膜染色;1 :>10%的浸润癌细胞呈现不完整的、微弱的细胞膜染色;2 :有两种情况,第一种为>10%的浸润癌细胞呈现不完整和/或弱至中等强度的细胞膜染色,第二种为≤10%的浸润癌细胞呈现强而完整的细胞膜染色;3 :>10%的浸润癌细胞呈现强而完整的细胞膜染色。对于2 的病例,应该用ISH做进一步检测,也可以选取不同的组织块重新检测或送条件更好的中心实验室进行检测。当出现下列情况时HER2状态为无法判读(indeterminate),包括标本处理不当、严重的组织挤压或边缘效应、检测失败等。应在报告中注明HER2状态无法判读的可能原因,并建议再次获取样本进行HER2检测。在乳腺浸润性微乳头状癌和部分有分泌现象的乳腺癌中,有时浸润癌细胞的细胞膜已呈很深的棕褐色,但却并未呈闭环状完整着色,存在一定程度的不连续性和间断胜,此时至少应视为HER2 2 ,并需要行ISH检测进一步明确HER2状态。建议在HER2 IHC检测报告中包括如下内容:患者信息(包括姓名、性别、年龄、门诊/住院号)、送检医师姓名、送检日期、标本信息(包括病理号和蜡块号)、标本部位和类型、抗体信息(克隆号/生产商)、检测方法、是否使用图像分析、对照设置情况、样本量是否适合评估、判读结果(O、1 、2 、3 )、检测结论(如阳性、不确定、阴性、无法判读)。

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    标本采集注意事项:

    1.1 材料收集日常外检标本104例, 其中肺组织78例、肠组织19例、胃组织5例、胸膜组织1例、脑组织1例。

    染色原理

    IHC染色法

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    DAB diaminobezidin 二氨基联苯氨(实验用DAB-H2O2):

    3,3-二氨基联苯胺(这是它的全名)

    免疫组织化学方法常用的显色液

    底物显色剂:

    DAB (3,3-二氨基联苯胺):显色后阳性反应产物呈棕褐色

    AEC (3,氨基-9- 乙基卡巴唑):显色后阳性反应产物呈红色或紫红色。

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    (检测HER2只是用苏木精衬染,不是用HE染色法)苏木精 — 伊红染色法 ( hematoxylin-eosin staining ) ,简称HE染色法 ,石蜡切片技术里常用的染色法之一 。

    苏木精在碱性溶液中呈蓝色,所以细胞核被染成蓝色。

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    In situ hybridisation:原位杂交

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    1、要在较为准确病变的部位采集病变标本。2、标本应及时处理,固定。以防止细胞自溶腐败。 3、避免异物掺入标本,如血液、粘液。4、无菌操作,动作快,以防止并发症和扩散。

    1.2 试剂益利化学品公司Verhoeff铁苏木精试剂盒、自配维多利亚蓝染液、马休黄、核固红、醛复红等。

    1、细胞核染色原理

    标本采集 :

    1.3 方法

    苏木精为碱性天然染料,可使细胞核着色。细胞核内染色质的成分主要是DNA,在DNA的双螺旋结构中,两条核苷酸链上的磷酸基向外,使DNA双螺旋的外侧带负电荷,呈酸性,很容易与带正电荷的苏木精碱性燃料以离子键或氢键结合而被染色。苏木精在碱性溶液中呈蓝色,所以细胞核被染成蓝色。

    1、直接法:在女性的外阴、阴道等部位采集时,要求患者在取材前一天避免性生活,盆溶、阴道灌洗、涂药和月经期。此法可用鼻咽、眼结合膜、皮肤、口腔和肛管、咽管等部位。

    1.3.1 Verhoeff铁苏木精染色法[1]

    2、细胞浆染色原理

    2、磨擦法:使用工具如海绵磨控器、线网套和气囊等,用于鼻咽、食管、胃等处。

    1.3.2 VBM染色法[1]组织切片脱蜡至水;

    细胞浆内主要成分是蛋白质,为两性化合物、细胞浆的染色与pH值有密切关系,当pH调到蛋白质等电点4.7-5.0时,胞浆对外不显电性,此时酸或碱性染料不易染色。当pH调到6.7-6.8时,大于蛋白质的等电点pH值,表现酸性电离,而带负电荷的阴离子,可被带正电荷的染料染色,现时胞核也被染色,核和胞浆难以区分。因此必须把pH调至胞浆等电点以下,在染液中加入醋酸使胞浆带正电荷(阳离子),就可被带负电荷(阴离子)的染料染色。伊红Y是一种化学合成的酸性染料,在水中离解成带负电荷的阴离子,与蛋白质的氨基正电荷(阳离子)结合而使细胞浆染色,细胞浆、红细胞、肌肉、结缔组织,嗜伊红颗料等被感染成不同程度的红色或粉红色,与蓝色的细胞核形成鲜明的对比。

    3、自行分泌:

    切片入70%乙醇中洗2 min;将切片浸入Victoria blue染色中2 h;用95%乙醇分化1 min;浸入蒸馏水中洗3次;用马休黄染色液染1 min;快速无水乙醇冲洗2次;二甲苯透明, 中性树胶封固。优化后步骤:将马休黄改为核固红, 滴染3~5 min。

    3、分化作用

    1)痰液:患者人深处咳出可疑痰液,如含有血液,立即涂片并固定。此法可用于呼吸道恶性病变,肺石棉沉着及肺霉菌感染等病。当出现嗜酸性粒细胞时也可用于过敏性哮喘的诊断参考。

    1.3.3 Gomori醛复红染色法[1]

    染色后,用某些特定的溶液将组织过多结合的染色剂脱去,这个过程称为分化作用,所用的溶液称为分化液。在HE染色中用0.5%盐酸乙醇作为分化液,因酸能破坏苏木精的醌型结构,使组织与色素分离而褪色。经苏木精染色后,必须用0.5%盐酸乙醇分化,使细胞核过多结合的苏木精染料和细胞浆吸附的苏木精染料脱去,在进行伊红染色,才能保证细胞核与细胞浆染色的分明。因此,在HE染色中分化是极为关键的一步。

    2)尿液:以离心后取其沉淀物。

    2 结果

    4、返蓝作用

    3)乳腺分泌物:于患处按摩挤出分泌物作涂片,或用针吸法后涂片检查。

    Verhoeff铁苏木精染色法:弹力纤维呈黑色或黑褐色弯曲线状, 细胞核呈黑色, 胶原纤维呈红色 。Gomori醛复红染色法:弹力纤维呈清晰紫色弯曲的线状 。VBM染色法:弹力纤维为蓝色或蓝绿色清晰弯曲线状, 背景为淡黄色 , 经改良步骤后染色:弹力纤维呈蓝色或蓝绿色弯曲线状, 细胞核呈红色 。

    分化之后,苏木精在酸性条件下处于红色离子状态,呈红色,在碱性条件下处于蓝色离子状态,呈蓝色。组织切片经0.5%盐酸乙醇分化后呈红色或粉红色,故分化之后,立即用水除去组织切片上的酸而终止分化,再用弱碱性水(0.2%氨水)使苏木精染上的细胞核呈现蓝色,这个过程称为返蓝作用或蓝化作用。另外用自来水浸洗也可使细胞核返蓝,但所需时间较长。

    4)前列腺液:按摩腺部取分泌物。

    图1 Verhoeff铁苏木精染色法图2 Gomori醛复红染色法图3 VBM染色法图4 VBM染色法加核固红复染图1~4均为肺组织

    染色步骤

    标本固定 :

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    涂片在尚未完全干燥时,投入固定剂中固定。以防止涂片细胞脱落。一般时间为10-30min。常用固定剂可选用:95%乙醇、乙醚-乙醇(乙醚与95%乙醇1:1混合),20%甲醛,甲醇及Carnoy液

    ——固定液:常用95%乙醇和冰丙酮

    巴氏染色法:

    ——苏木精染液:称取苏木精粉0.5g,铵矾24g溶解于70ml蒸馏水中,然后取NaIO 31g,水5ml,再加入甘油30ml和冰醋酸2ml,混合均匀,滤纸过滤,备用。

    试剂配制:

    ——伊红染液:称取0.5g水溶性伊红染液,溶于100ml蒸馏水中。

    OG6染液 桔黄G0.5g 95%乙醇100ml 磷钨酸0.015g EA36染液 0.5%亮绿SF水溶液15ml 0.5%伊红Y水溶液45ml 0.5%俾士麦棕水溶液10ml 磷钨酸0.2g 碳酸锂饱和水溶液1滴

    ——稀盐酸乙醇溶液:用75%乙醇配制1%盐酸。

    染色方法

    ——系列浓度的乙醇、二甲苯、中性树胶。

    1、涂片固定后经梯度乙醇至水。2、苏木素液染5-10min。流水冲洗返蓝。3、OG6染液1-2min后,用95%乙醇洗两次。 4、入EA36或EA65染液2-3min。5、用95%乙醇洗两次,分色。6、梯度乙醇脱水,二甲苯透明,中性树胶封固。结果:细胞核呈蓝色。表层扁平细胞质粉红色。中间与基底旁细胞胞质蓝至绿色。

    1.样品制备

    生技网(www.biogo.net)

    对于贴壁生长细胞,胰酶消化,调整细胞浓度约1×105/ml,滴加于盖玻片上(置于6孔板中),培养相应时间后,取出细胞爬片,用PBS 洗涤3次。

    2.样品固定

    95%乙醇固定20min,PBS洗涤2次,每次1min。

    3.染核

    苏木素染液染色2-3min,自来水洗涤。

    4.分色

    镜下观察,若细胞核染色过深,用1%盐酸酒精溶液分色数秒,自来水洗涤。

    5.染胞质

    浸入伊红染液染色1min,自来水洗涤。

    6.封片

    吹干或自然晾干细胞 爬片后,中性树胶封片。

    注意事项

    一、pH值的调节

    如果组织块在福尔马林中固定时间长,组织酸化而影响细胞核着色。因此,要在自来水中冲洗时间长一些或在饱和碳酸锂水溶液中处理10-30min,这样可以使细胞核着色较深。染伊红时胞浆着色不佳,可在伊红溶液中滴加1-2滴冰醋酸。

    二、分色时间的控制

    分色这一步是关键,应在显微镜下控制进行,一般以细胞核染色清楚(晰)而细胞质基本无色为佳。如果过分延长分色时间将导致染色太浅,应重新染色后再行分色。

    三、酒精脱水应彻底

    切片经酒精脱水后,入二甲苯时可出现白色不透明状态,此为脱水不彻底,应将切片退回无水酒精,更换酒精、二甲苯,以求彻底脱水与透明。 切片从二甲苯取出或进入二甲苯前,切片周边均应擦干净或吸干多余水分。

    四、避免切片干燥

    在染色过程中不要让切片干燥,以免切片收缩、变形,影响神经元形态。

    五、避免切片污染

    出现切片污染,污染物遮盖该部位的细胞或组织难以观察期形态改变。应定期过滤各种染液和试剂以避免其中的沉淀物所引起的污染。

    六、避免脱蜡不完全

    冬季室温低时(14℃以下),二甲苯应在水浴缸中适当加温到30℃后再脱蜡,以避免因脱蜡不完全引起的染色不均匀呈雾化状态。

    七、封片注意事项

    最后封固时,要用中性树脂,防止日后褪色,盖片要选大于组织块的面积,如漏出一部分不久将会褪色,所用树脂浓度要适当,树脂封固时不能有气泡。

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