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杂交瘤细胞的保存方法,细胞的选择

发布时间:2019-08-27 07:13编辑:生命科学浏览(62)

    核心提示:保存 当获得产生所需的单克隆抗体的杂交瘤细胞后,必须将一部分杂交瘤细胞保存,否则在连续传代的过程中,可能产生突变保存澳门金莎娱乐网址, 当获得产生所需的单克隆抗体的杂交瘤细胞后,必须将一部分杂交瘤细胞保存,否则在连续传代的过程中,可能产生突变或染色体的漂移以至丧失固有特性或丢失产生抗体的特性。另外在长期的培养过程中,难免不发生污染以至于毁灭。所以必须冷藏保存一部分。保存方法如下:1.材料 细胞:取对数生长期的细胞。 10%二甲基亚砜保护液(二甲基亚砜能损坏滤器,而又被高压所破坏,所以不能过滤或高压消毒。其本身就是毒品,无菌):含10%二甲基亚砜、20%灭活胎牛血清,70%RPMI―1640液。 20%FCS―1640培养液:含青霉素100U/ml,链霉素100μg/ml。 灭菌的2ml安瓶等2.操作方法 去掉细胞培养瓶中的旧的培养液,加入10%FCS―1640液,使细胞悬浮。 1 000r/min离心10min,去上清。细胞沉淀用10%二甲基亚砜保护液制成悬液,使成1.0×107细胞/ml。 取样,台盼兰染色,计数活细胞,应在95%以上。 用注射器将细胞分装安瓶,每瓶0.5ml~1.0ml,熔封安瓶。 放4℃ 2h。 放液氮罐气态部分15h。 转入液氮部分。复苏1.从液氮罐中取出安瓶立即放37℃水浴中速溶。2.无菌操作打开安瓶,取出细胞悬液,转入组织培养瓶。3.逐滴缓慢加入20%FCS-1640培养液3.5ml,这个过程延续3min。4.5%CO2饱和湿度,37℃培养。5.4h后弃去培养液上清,加入新鲜的20%FCS-1640培养液。6.继续培养,换液,以至形成单层。

    核心提示:脾细胞1.材料 免疫过的血清抗体滴度高的Balb/c鼠。 1640培养液 2.5%FCS-1640营养液2.操作方法 拉颈

    核心提示:脾细胞 1.材料 免疫过的血清抗体滴度高的Balb/c鼠。 脾细胞 1.材料 免疫过的血清抗体滴度高的Balb/c鼠。 1640培养液 2.5%FCS-1640营养液 2.操作方法 拉颈或用CO2处死小白鼠。 将小鼠放于70%酒精中浸泡消毒,取出固定于板上,在无菌条件下取脾。 把脾放入5ml含有2.5%FCS的1640液中,冰浴下轻轻洗去脾上的红血球。 用镊子轻轻挤压脾,做成脾细胞悬液,用毛细管将悬液移入小试管中。 直立小试管3min,使大块的结缔组织下沉,把细胞悬液移入离心管中。 以2.5%FCS―1640充满离心管,并以400g离心7min~10min(与此同时应开始制备骨髓细胞)。 把沉淀用约10ml的新鲜培养液再悬浮。 重复⑹、⑺步骤。 计算细胞,以台盼兰染色用相差显微镜检查,活细胞数应高于80%为合格。 骨髓瘤细胞 骨髓瘤细胞能产生并分泌大量的免疫球蛋白,这样的瘤细胞融合后,可能影响或降低所分泌抗体的滴度,所以必须选育出非分泌免疫球蛋白缺陷型的骨髓瘤细胞。 选择骨髓瘤细胞的条件:①该瘤细胞系的来源应与制备脾细胞小鼠为同一品系,以便两者的组织相容性抗原一致;②骨髓瘤细胞必须是静息状态,不产生γ球蛋白或不分泌到细胞外;③骨髓瘤细胞生长需要一个较高的细胞密度,最好106个细胞/ml;④生长速度快,繁殖时间短。 目前常用的Balb/c小鼠产生的骨髓瘤细胞株有:①S194/5XXO・BU・1;②SP2/0―Ag14;③P2―X?­―Ag8・6・5・3;④FO 以653最为常用,它是由矿物油4-甲基-15烷(Pristane,降植烷)诱发出来的一种浆细胞瘤(MinerolOilplasmacytoma,MOPC)并经过培育形成一株8-氮鸟嘌呤有抵抗力的亚系。 骨髓瘤细胞一般由有关单位直接引入,保存于-195℃液氮罐中,试验时复苏、增殖、传代即可。 由于骨髓瘤细胞是半贴壁状态,很容易脱落,因此不需要胰酶处理。为了防止出现返祖现象,在融合前,可将培养基内加入15μg/ml8-氮鸟嘌呤。取约1×107~6×107对数生长期(即培养15h~20h)的骨髓瘤细胞,在室温离心10min,沉淀以2.5%FCS―1640液再悬浮并计数。 饲养细胞 在体外的细胞培养中,单个的或数量很少的细胞不易生存与繁殖,必须加入其它活的细胞才能使其生长繁殖,加入的细胞称之为饲养细胞(Feedercell)。在细胞融合和单克隆的选择过程中,就是在少量的或单个细胞的基础上使其生长繁殖成群体,因此在这一过程中必须使用饲养细胞。许多种类的动物细胞都可以做饲养细胞,如正常的脾细胞、胸腺细胞、腹腔渗出细胞等,常选用腹腔渗出细胞,其中主要是巨噬细胞和淋巴细胞。应用腹腔渗出细胞的好处是:一方面做饲养细胞,另一方面巨噬细胞可以吞噬死亡的细胞和细胞碎片,为融合细胞的生长造成良好的环境。腹腔细胞的来源可以是与骨髓瘤细胞同系鼠。也可以是其他种类的小鼠,如C57鼠,昆明小白鼠等。 1.材料 小鼠(Balb/c或C57小白鼠)若干只。 11.6%蔗糖溶液(经10磅30min高压灭菌)。 2.操作方法 拉颈处死小鼠。 70%酒精浸泡消毒10min。 用手术剪将小鼠腹部剪开一小口,剥开皮肤,露出腹腔。 用注射器将4ml11.6%蔗糖溶液注入腹腔,用手指轻揉1min仍用该注射器回抽腹腔液体,加入离心管。 1000r/min离心10min。 取上清,以HAT选择培养液将细胞制成悬液。台盼蓝染色计数活细胞,使每毫升含40万个活细胞。 以1ml吸管将细胞种入微量培养皿,每孔0.05ml,含2万个细胞,放入CO2培养箱培养,即可供细胞融合和克隆化之用。如果在融合后发现在培养孔中饲养细胞数量少,则可以在细胞换液时再加入一些。

    核心提示:抗体检测用检测抗体的方法从杂交细胞中筛选出生产指定抗体的杂交株是很重要的。检测抗体的方法很多,从沉淀反应到放射抗体检测用检测抗体的方法从杂交细胞中筛选出生产指定抗体的杂交株是很重要的。检测抗体的方法很多,从沉淀反应到放射免疫测定。由于细胞培养液中的抗体浓度通常是很低的,而且传统的检测方法多是以多价抗原与多克隆抗血清相反应。杂交瘤产生的抗体则是单克隆的,所以并不是每项方法都能适用。一定要选择敏感的、快速的、一次又能检测多份样品的方法。常用的检测方法如下:1.试管溶血反应检测法材料:①杂交瘤细胞,换液后至少两天才收取培养液;②绵羊红血球,洗涤三次后,配成1%悬液;③豚鼠补体,无菌采取补体,以pH7.2PBS稀释成20%溶液,分装小瓶,于��40℃保存。使用时以补体和压积红血球5:1的量进行吸收,4℃30min,然后2 000r/min离心10min,去红血球,取上清液备用;④0.01Mol/L pH7.2PBS液。操作方法:①在小试管中,加入0.1ml杂交瘤细胞用过的培养液,再加入0.1ml pH7.2的PBS液,然后倍比稀释至一定的稀释度;②加入0.1ml补体和1%绵羊红血球0.1ml,混匀后置37℃水浴1h;③观察结果,以绵羊红血球完全溶解的杂交瘤细胞培养液的最高稀释倍数为抗体的溶血效价。2.斑点检测法 抗红血球表面的单克隆抗体与浇灌在琼脂板的红血球结合,进而结合补体,而发生溶血斑点,对着光源用肉眼即可判定。材料:①绵羊红血球,处理同试管法,最后配成25%红血球悬液;②新鲜豚鼠血清;③琼脂糖,配成0.6%PBS液,水浴中溶化;④0.01Mol/L pH7.2PBS液;⑤兔抗羊红血球抗体。操作方法:①将溶化的0.6%琼脂糖倒入一试管中,置45℃~48℃水浴中;②加0.1ml 25%红血球悬液,0.1ml豚鼠补体,迅速混匀,倾注一干净载玻片上;③ 凝固后,在凝胶表面固定区域滴加2ml待测样品,标准阳性血清和对照试液;④待溶液全部渗入凝胶后,置湿盘;⑤37℃温育1h~2h,观察并判定结果。 强阳性 中等阳性 弱阳性 阴性(��)必要时可置室温过夜,再判定一次。3.膜荧光检测法材料:①培养液HEM或RPMI-1640;②荧光试剂:异硫氰酸荧光素标记的抗小鼠免疫球蛋白;③50%甘油缓冲液:1份甘油加1份体积0.05Mol/L pH 7.2 PBS 液混合即成;④荧光显微镜、载玻片、盖玻片、吸管等。操作方法:①用培养液洗涤二次细胞,悬浮成2.0×107/ml;②50µl细胞悬液加50μl培养上清液混合,置4℃30min,用培养液洗涤3次,1 000r/min离心;③以50µlFITC―抗小鼠免疫球蛋白重新悬浮压积细胞,水浴30min~60min;④用冷培养液洗3次细胞,重新悬浮;⑤取一滴细胞悬液滴在玻片上,复盖片,用甘油缓冲液封固,置荧光显微镜下观察。着色细胞也可以在固定后观察,一滴细胞悬液,涂片、风干,用95%酒精固定10min,固定后的载玻片用PBS洗涤,盖上盖玻片,进行观察。4.免疫球蛋白和亚类球蛋白的检测 以琼脂双扩散试验法进行,此法简单易操作,特异性好。注意必须将培养液浓缩10~50倍,否则做双向琼扩不出现沉淀线。其检测方法为:制备各种兔抗小鼠IgG1~4、 IgM1~2、IgA1~2和K、λ抗血清,也可直接购买。取5ml培养物的上清液缓慢加入0.5ml的饱和硫酸铵溶液,混匀,静置3h,离心沉淀,去上清,沉淀加0.05ml蒸馏水溶解。制成1%琼脂糖凝胶板,打孔。中间孔加20μl浓缩上清液,周围孔加20µl特异性抗血清,以10μl正常小鼠血清作对照。也可以采用酶联免疫吸附试验、间接血凝试验以及放射免疫等方法检测。杂交瘤细胞的选择经HAT选择培养基培养10~14天,未经融合的骨髓瘤细胞相继死去,而杂交瘤细胞即可逐渐长成细胞集落。停用HAT液后,改用HT培养基。当细胞集落面积超过培养孔的1/10以上时,即可用敏感的免疫学方法检测出阳性孔。连续三次检测逐渐升高或维持在同一水平者,则可以做克隆化,一部分则冷藏起来做长期保种用。

    脾细胞

    1.材料

    免疫过的血清抗体滴度高的Balb/c鼠。

    1640培养液

    2.5%FCS-1640营养液

    2.操作方法

    拉颈或用CO2处死小白鼠。

    将小鼠放于70%酒精中浸泡消毒,取出固定于板上,在无菌条件下取脾。

    把脾放入5ml含有2.5%FCS的1640液中,冰浴下轻轻洗去脾上的红血球。

    用镊子轻轻挤压脾,做成脾细胞悬液,用毛细管将悬液移入小试管中。

    直立小试管3min,使大块的结缔组织下沉,把细胞悬液移入离心管中。

    以2.5%FCS—1640充满离心管,并以400g离心7min~10min(与此同时应开始制备骨髓细胞)。

    把沉淀用约10ml的新鲜培养液再悬浮。

    重复⑹、⑺步骤。

    计算细胞,以台盼兰染色用相差显微镜检查,活细胞数应高于80%为合格。

    骨髓瘤细胞

    骨髓瘤细胞能产生并分泌大量的免疫球蛋白,这样的瘤细胞融合后,可能影响或降低所分泌抗体的滴度,所以必须选育出非分泌免疫球蛋白缺陷型的骨髓瘤细胞。

    选择骨髓瘤细胞的条件:①该瘤细胞系的来源应与制备脾细胞小鼠为同一品系,以便两者的组织相容性抗原一致;②骨髓瘤细胞必须是静息状态,不产生γ球蛋白或不分泌到细胞外;③骨髓瘤细胞生长需要一个较高的细胞密度,最好106个细胞/ml;④生长速度快,繁殖时间短。

    目前常用的Balb/c小鼠产生的骨髓瘤细胞株有:①S194/5XXO·BU·1;②SP2/0—Ag14;③P2—X? ­—Ag8·6·5·3;④FO

    以653最为常用,它是由矿物油4-甲基-15烷(Pristane,降植烷)诱发出来的一种浆细胞瘤(Minerol Oil plasmacy toma,MOPC)并经过培育形成一株8-氮鸟嘌呤有抵抗力的亚系。

    骨髓瘤细胞一般由有关单位直接引入,保存于-195℃液氮罐中,试验时复苏、增殖、传代即可。

    由于骨髓瘤细胞是半贴壁状态,很容易脱落,因此不需要胰酶处理。为了防止出现返祖现象,在融合前,可将培养基内加入15μg/ml 8-氮鸟嘌呤。取约1×107~6×107对数生长期(即培养15h~20h)的骨髓瘤细胞,在室温离心10min,沉淀以2.5%FCS—1640液再悬浮并计数。

    饲养细胞

    在体外的细胞培养中,单个的或数量很少的细胞不易生存与繁殖,必须加入其它活的细胞才能使其生长繁殖,加入的细胞称之为饲养细胞(Feeder cell)。在细胞融合和单克隆的选择过程中,就是在少量的或单个细胞的基础上使其生长繁殖成群体,因此在这一过程中必须使用饲养细胞。许多种类的动物细胞都可以做饲养细胞,如正常的脾细胞、胸腺细胞、腹腔渗出细胞等,常选用腹腔渗出细胞,其中主要是巨噬细胞和淋巴细胞。应用腹腔渗出细胞的好处是:一方面做饲养细胞,另一方面巨噬细胞可以吞噬死亡的细胞和细胞碎片,为融合细胞的生长造成良好的环境。腹腔细胞的来源可以是与骨髓瘤细胞同系鼠。也可以是其他种类的小鼠,如C57鼠,昆明小白鼠等。

    1.材料

    小鼠(Balb/c或C57小白鼠)若干只。

    11.6%蔗糖溶液(经10磅30min高压灭菌)。

    2.操作方法

    拉颈处死小鼠。

    70%酒精浸泡消毒10min。

    用手术剪将小鼠腹部剪开一小口,剥开皮肤,露出腹腔。

    用注射器将4ml 11.6%蔗糖溶液注入腹腔,用手指轻揉1min仍用该注射器回抽腹腔液体,加入离心管。

    1 000r/min离心10min。

    取上清,以HAT选择培养液将细胞制成悬液。台盼蓝染色计数活细胞,使每毫升含40万个活细胞。

    以1ml吸管将细胞种入微量培养皿,每孔0.05ml,含2万个细胞,放入CO2培养箱培养,即可供细胞融合和克隆化之用。如果在融合后发现在培养孔中饲养细胞数量少,则可以在细胞换液时再加入一些。

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